Предыстория: Появляются новые данные, свидетельствующие о том, что клеточный ROS, включая оксид азота (NO), являются важными медиаторами при воспалении и остеоартрите (ОА). Было продемонстрировано, что водорастворимая полигидроксилированная наночастица фуллерена C60 (фуллерол) обладает выдающейся способностью удалять ROS.Цель: Целью данного исследования является оценка влияния фуллерола на воспаление и ОА с помощью исследований in vitro и in vivo. Методы: Для экспериментов in vitro первичные перитонеальные макрофаги мыши и линия макрофагов RAW264.7 стимулировали воспалительные фенотипы липополисахаридом (LPS) в присутствии фуллерола. Для исследования на животных модель ОА была создана путем внутрисуставной инъекции монойодоацетата в коленные суставы крыс, а фуллерол вводили внутривенно сразу после индукции ОА. Результаты: Производство NO и экспрессия провоспалительных генов, индуцированных LPS, были значительно снижены фуллеролом в обоих типах клеток макрофагов. Между тем, фуллерол может значительно уменьшить фосфорилирование митоген-активированной p38 протеинкиназы и уровень белка факторов транскрипции ядерного фактора-каппаB и фактора транскрипции форки 1 в ядре. Исследование на животных подстало, что систематическое введение фуллерола предотвращает ОА, подавляя воспаление синовиальных мембран и повреждение хрящевых хондроцитов в суставах ОА.Вывод: Антиоксидантный фуллерол может иметь потенциальное терапевтическое применение для ОА.
Рисунок 1 Фуллерол может снизить экспрессию TNF-α, IL-1β, IL-6 и iNOS и выработку нитритов в первичных перитонеальных макрофагах мыши. Примечания: Фуллерол не был токсичным при дозах до 3 µМ (A, анализ WST-1). Фуллерол подавлял индуцированное LPS производство нитритов (B, тест реагента Griess) и экспрессию гена iNOS (C, количественный анализ RT-PCR). Это также обратило вспять стимулируемое LPS производство TNF-α (D, анализ ELISA; E, количественный анализ RT-PCR) и экспрессию воспалительных цитокинов IL-1β и IL-6 (F, количественный анализ RT-PCR). LPS: лечение LPS (100 нг/мл); LPS + FUL: лечение LPS (100 нг/мл) в сочетании с фуллеролом (1 µM). Сокращения: FUL, фуллерол; NT, без лечения; iNOS, индуцированная синтаза оксида азота; LPS, липополисахарид; TNF, фактор некроза опухоли.
Рисунок 2 Фуллерол может снизить выработку нитритов и экспрессию TNF-α, IL-6 и IL-1β в клеточной линии макрофагов RAW264.7. Примечания: Фуллерол не был токсичным при дозах до 3 µМ (A, анализ WST-1). Фуллерол подавлял индуцированное LPS производство нитритов (B, тест реагента Griess) и экспрессию гена iNOS (C, количественный анализ RT-PCR). Это также обратило вспять стимулируемое LPS производство TNF-α (D, анализ ELISA; E, количественный анализ RT-PCR) и экспрессию воспалительных цитокинов IL-1β и IL-6 (F, количественный анализ RT-PCR). LPS: лечение LPS (100 нг/мл); LPS + FUL: лечение LPS (100 нг/мл) в сочетании с фуллеролом (1 µM); LPS + DEX: обработка LPS (100 нг/мл) в сочетании с дексаметазоном (25 µM). Для всех анализов в каждой группе было проведено четыре повторения (n=4).Сокращения: FUL, фуллерол; NT, без лечения; iNOS, индуцированная синтаза оксида азота; LPS, липополисахарид; TNF, фактор некроза опухоли.
Рисунок 3 Фуллерол подавляет слияние клеток и образование мультиядерных клеток в клеточной линии макрофагов RAW264.7. Примечания: Клетки были окрашены FITC-конъюгированным фаллоидином, пептидом с высокой способностью связываться с микрофиламентным компонентом F-актином. (A) Изображения были сделаны под флуоресцентным микроскопом; (B) номера многоядерных клеток в случайно выбранной области, состоящей из 50 ядер в клеточных культурах с различной обработкой. Слияние клеток, которое привело к образованию мультиядерного, было вызвано LPS, а индукционный эффект LPS был ингибирован добавлением фуллерола. LPS: лечение LPS (100 нг/мл); LPS + FUL: лечение LPS (100 нг/мл) в сочетании с фуллеролом (1 µM). Сокращения: FUL, фуллерол; NT, без лечения; LPS, липополисахарид.
Рисунок 4 Фуллерол снижает уровни белка TLR4 (A) и p-P38 (C) в цитозольной фракции и NFkB (B) и FoxO1 (D) в ядерной фракции, определяемой западным блотом. Клетки обрабатывались 100 нг/мл только LPS (LPS) или 100 нг/мл LPS вместе с 1 µM фуллерола (LPS + FUL). Было показано, что уровни белка этих сигнальных молекул были значительно ниже в группе LPS, чем в группе LPS + FUL. *P<0,05, n=3.Сокращения: FUL, фуллерол; FoxO1, фактор транскрипции Forkhead Box 1; LPS, липополисахарид; NFkB, ядерный фактор-kappaB; TLR, toll-подобный рецептор.
Рисунок 5 Репрезентативное окрашивание H&E синовия из коленных суставов крысы (контроль: PBS, травмированный: MIA) с (FUL) или без (NT) лечения фуллеролом в течение 5 дней. Примечания: Фуллерол 2 мг/кг веса вводился внутривенно сразу после инъекции MIA. Результаты показали, что фуллерол уменьшает количество эритроцитов (синие стрелки) и фибробластоподобные клетки (черные стрелки) в синовии поврежденного колена, видимого на изображении вверх/влево группы MIA/NT.Сокращения: FUL, фуллерол; MIA, монойодоацетат; NT, без лечения.
Рисунок 6 Репрезентативный сафранин O/Быстрое зеленое окрашивание коленных суставов крыс (A, контроль: PBS, травмированный: MIA) и бедренного суставного хряща (B) в обоих суставах с (Ful) или без (NT) лечения фуллеролом. Примечания: Остеоартрит был вызван в коленных суставах путем внутрисуставной инъекции MIA на сроко в течение 21 дня. Было показано, что вызванные MIA гистопатологические изменения, включая снижение производства матрицы и толщины суставного хряща, эрозию суставного хряща, дезориентацию хондроцитов, фибрилляцию поверхностной зоны и обнажение субхондральной кости, были зависимыми от времени (A). Фуллерол облегчает потерю матрицы, хондроцитов (черные стрелки) и толщины хряща (черные линии и гистограмма) в бедренном суставном хряще (B). Сокращения: MIA, монойодоацетат; NT, без лечения.
Рисунок 7 Предлагаемый механизм, лежащий в основе ингибирующего воздействия фуллерола на экспрессию генов, связанных с воспалением, в макрофагах, активированных LPS. Символ ⊝ представляет собой ингибирование фуллерола против свободных радикалов, образующихся после связывания LPS с его лигандом TLR4. p38 MAPK играет ключевую роль в регулировании. С помощью факторов транскрипции, NFkB и FoxO1, экспрессия целевых генов регулировалась. Снижение экспрессии iNOS и TLR4 снижает клеточный уровень реактивных азотных форм (RNS) и белка TLR4, что еще больше сводит к минимуму воспалительные эффекты LPS. Стоит отметить, что другие сигнальные пути также могут быть вовлечены в противовоспалительное фуллерол. Сокращения: FoxO1, фактор транскрипции Forkhead box 1; iNOS, индуцированная синтаза оксида азота; LPS, липополисахарид; NFkB, ядерный фактор-kappaB; TLR, toll-подобный рецептор.
Источник: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31239673/